Die Kirche St. Margarethen liegt westlich außerhalb der historischen Stadtmauern Ascherslebens. Dennoch dürfte diese Kirche sehr alt sein. Die Lage der westlichen Neustadt mit dem Übergang des Flüsschens Eine und der alten Straße in die Bischofstadt Halberstadt begünstigten die Anlage einer Siedlung samt der dazugehörigen Kirche. Erstmals urkundlich erwähnt wurde die Kirche St. Margarethen im Jahre 1303 als Filial der ungleich größeren Stadtkirche St. Stephani zu Aschersleben. Bei einem der zahlreichen Stadtbrände, die das mittelalterliche Aschersleben verheerten, wurde St. Margarethen im Jahre 1410 eingeäschert. Bis in das Jahr 1586 blieb sie wüst und ungenutzt liegen. Erst in diesem Jahre wurde sie wieder aufgebaut, um der damals offensichtlich überhandnehmenden Abwendung der Bevölkerung von der Kirche entgegenzuwirken.
Der in Mitteldeutschland so verheerend wütende Dreißigjährige Krieg hat auch der Margarethenkirche stark zugesetzt. 1636 wurde die Kirche geplündert und 1640 das Haus des Küsters niedergebrannt. Dennoch wurden im Jahre 1642 ein Oberstleutnant der kaiserlichen Truppen und zwei Jahre später ein Graf Königsmark in der Kirche beigesetzt. Offenbar hat sich die Kirchengemeinde aber relativ schnell von den Folgen des Krieges erholt, denn bereits 1648 wurde das Küsterhaus wieder aufgebaut. Die Umbauten der Jahre 1715 bis 1717 haben der kleinen Kirche bis heute ihr Gepräge gegeben.